シングルセル・マルチオミクス技術で、3次元ゲノムと遺伝子発現の関係を明らかにする

高等真核生物では、核内におけるゲノムの三次元的空間コンフォメーションが細胞機能にとって重要である。例えば、エンハンサーはしばしば、3次元的な空間的相互作用を通して、遠位標的遺伝子の転写活性を制御する

高等真核生物では、核内におけるゲノムの三次元的空間コンフォメーションが細胞機能にとって重要である。例えば、エンハンサーは、3次元的な空間的相互作用を通じて、遠くの標的遺伝子の転写活性を制御することが多い。1-3 3次元ゲノムレベルの異常は、がんを含む様々な疾患の発症と強く関連していることも判明している。4-6 しかし、3次元ゲノムと遺伝子発現の全体的な関係についてはまだ議論の余地がある。例えば、重要な制御タンパク質であるCTCFやコヒーシンを標的としたクロマチン空間コンフォメーションの分解によって、ゲノムの空間コンフォメーションに有意な再配列が起こることがあるが、遺伝子発現には比較的弱い影響しか及ぼさない7-9。ショウジョウバエ胚では、遺伝子発現は細胞種間で大きく異なるが、クロマチン構造の差は大きくない10,11。したがって、複雑な組織や器官、豊富な細胞種を背景に、クロマチン立体構造と遺伝子発現の関係をさらに理解するためには、より強力なツールが早急に必要である。

研究グループは、「Linking genome structures to functions by simultaneous single-cell Hi-C and RNA-seq」と題する論文を学術誌「Science」に発表し、新規の単一細胞マルチオミクス手法であるHiRES（HiC and RNA-seq employed simultaneously）は、単一細胞レベルでトランスクリプトームと3次元ゲノムを同時に検出できる初めてのシーケンスベースの方法であると報告しました。

HiRES法では、細胞集団レベルでin situ逆転写とクロマチンコンフォメーションキャプチャー（3C）を行い、その後フローソーティングで単一細胞を取得し、増幅後に各細胞の塩基配列を決定します（図1A）。DNAまたはRNAのリードは、逆転写の際に導入されたRNA認識配列によって区別されるため、この方法ではDNAとRNAを物理的に分離する必要がなく、検出効率が最大化されます。マウスの脳サンプルでは、1細胞あたり平均6,517個の遺伝子、27,468個の転写物（UMI）、317,435個のクロマチン相互作用を検出することができます（図1B、C）。このデータを用いて、研究者は単一細胞の3Dゲノムの高解像度構造再構成を行い、3D構造上の遺伝子発現レベルの観察を行うことができます（図1D, E）。

図1 HiRES法により、単一細胞のトランスクリプトームと3Dゲノムを効率的に検出できる。 A）HiRES法のフローを模式的に示す。 (B）MALBAC-DT法とHiRES法で検出された遺伝子数と転写産物数。 (C）Dip-C法とHiRES法の両方で検出されたクロマチン相互作用の数。 (B）MALBAC-∆T (E）単細胞クロマチンの立体構造上での遺伝子発現の例。 ボールの大きさは発現レベルを表す。

その後、研究チームはHiRES法を用いて、妊娠7日目から11.5日目までのマウス胚の合計7469個の単一細胞のトランスクリプトームと3次元ゲノムをマッピングした。 このデュアルオミクスデータの解析により、研究チームは以下の点を探ることができた：

I. 異なる細胞タイプにおける3次元ゲノムへの細胞周期の影響

胚発生期の細胞は急速な増殖過程にあり、細胞周期が3次元ゲノムに与える影響は無視できない。 本研究では、HiRESバイモーダルデータを用いて、単一細胞における細胞周期の描出戦略を開発した。 この戦略は、DNA空間相互作用特性、細胞周期関連遺伝子の発現、DNA複製の程度などの指標に依存し、単一細胞を異なる細胞周期状態のいずれかに割り当てることを可能にする（図2）。

図2 バイコモ特徴量を用いた細胞周期状態のアノテーション。 図中の各列は単一細胞である。

胚組織では、クロマチン構造と細胞周期の状態に従って定義された細胞分類間で、より大きな一致が見られた。このことは、細胞周期に伴うクロマチン構造の変化が、全体的なクロマチンの空間的コンフォメーションに大きな影響を与えていることを示唆している。 本研究では、異なる細胞型間で、細胞周期中のクロマチン構造を比較する半定量的な方法を開発し、間期細胞におけるクロマチン構造は、有糸分裂後の自発的な染色体の展開とゲノムの複製という2つの独立したプロセスによって決定されることを見出した。 G1期が短い細胞種では、これら2つの過程は時間的に重なり、その結果、クロマチンの3次元構造の細胞周期ダイナミクスが共に決定される可能性がある。

II.異なる細胞タイプ間のクロマチン相互作用の違いは細胞機能と密接に関係している

異なる細胞タイプ間のクロマチン構造の差異の研究は、3Dゲノム研究の重要な課題の一つである。 Hi-C技術を用いたクロマチン相互作用の差の探索は、データの疎らさ、高いノイズ、生物学的複製数の少なさなどの困難にしばしば直面する。 これらの問題に対処するため、本研究では、再構成された2つのシングルセル全ゲノム3次元構造における2点間の空間的距離について非参照検定を行うことにより、差次的クロマチン相互作用（DI）を効率的に検出できるSimple Diff戦略を考案した。 この手法に基づき、研究チームは、原腸形成期にクロマチン構造の特殊化が起こること、差次的発現遺伝子が差次的クロマチン構造座位で有意に濃縮されることを発見し、クロマチン構造の変化が細胞機能と密接に関係していることを示唆した。

これに基づき、本研究ではさらに、クロマチン相互作用の強度と遺伝子発現レベルの相乗的変化を利用して、差次的相互作用とその潜在的関連遺伝子を結びつけ、遺伝子発現と有意に関連するこれらの差次的相互作用をGADI（gene-associated DI）と名付けた。 GADIは多くの場合、プロモーターとエンハンサーやスーパーエンハンサーのような遠位制御エレメントを結びつけることが分かっている（図3）。 このように、GADIは転写活性の結果であるだけでなく、細胞種特異的な遺伝子発現制御の根底にあると考えられる多くの潜在的なエンハンサー-プロモーター相互作用を含んでいる。

図3 DccおよびDlc1遺伝子に連結されたGADIの例

III.遺伝子の転写活性化に先行する広範なクロマチン構造再配列の発見

クロマチン相互作用を特定の遺伝子に結びつけた後、本研究ではさらに、提案された時系列におけるクロマチン構造変化と転写レベルの変化の間の連続的関係を比較し、転写変化に先行する40,000以上のクロマチン相互作用変化を同定した。 これらのクロマチン空間構造変化部位をエピジェネティックに解析した結果、転写に先行するこのようなクロマチン構造変化は、主に2つのカテゴリーに分類されることが明らかになった。第1に、ほとんどの遺伝子座において、遺伝子発現に先行するクロマチン構造再配列は、主にエンハンサー活性化によって駆動される可能性のある活性クロマチン間で確立される。 は、ヘテロクロマチン構造の弛緩の必要性によって先行する（図4）。 両過程の背後にあるより詳細な分子メカニズムは、今後さらに解明される必要があるが、この結果は、クロマチンの三次元構造が遺伝子発現の制御に広く関与しているという考えを強く支持するものである。