代謝異常は非アルコール性脂肪性肝炎患者の特異的脂質シグネチャーを誘導する

非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）は、肝硬変や肝細胞癌に進行する可能性のある疾患である。NASH診断のためのマーカーはまだ不足している。我々は、正常肝、非アルコール性脂肪肝、NASHを含むヒト肝生検の包括的リピドミクス解析を行った。ランダムフォレストに基づく機械学習アプローチにより、32種類の脂質からなるNASHを100％の感度と特異度で識別するシグネチャーを特徴付けることができた。さらに、このシグネチャーをNASH患者の独立したグループで検証した。次に、患者とマウスモデルの両方で代謝異常を調べた。脂肪酸合成経路に沿って、エロンガーゼ活性とデサチュラーゼ活性の変化が観察された。デサチュラーゼFADS1の活性低下はボトルネックとして現れ、上流では脂肪酸の蓄積を、下流では長鎖脂肪酸の欠乏をもたらし、リン脂質の合成障害を引き起こした。NASHでは、組織切片の質量分析イメージングにより、選択的に蓄積した脂肪酸が肝実質に広がっていることが明らかになった。このような脂質は、ヒト肝細胞に対して非常に毒性の高い混合物を構成していた。結論として、本研究は、NASHの特異的で高感度な脂質シグネチャーを特徴付け、FADS1をNASH進行中の有毒脂質の蓄積における重要なプレーヤーとして位置づけた。

非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、非アルコール性脂肪肝（NAFL）と呼ばれる脂肪症から非アルコール性脂肪肝炎（NASH）に至る幅広い病変を含む病態である。NASHは、肝線維化、肝硬変、肝細胞がんに進展する可能性があることが確立されている1,2。NAFLDは、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、メタボリックシンドロームと関連する全身疾患である3。さらに、NAFLDは非肥満者にも認められることがあり、その有病率は痩せ型の人で3.5％から27％である4。したがって、NAFLDの発生率は劇的に増加しており、慢性肝疾患の最も一般的な原因となっており、世界的に公衆衛生上の大きな問題となっている5,6。

脂肪性肝疾患の特徴は、脂質、特にトリグリセリドの細胞内蓄積であり、肝細胞内に脂質滴が形成される。この蓄積は、脂肪酸の取り込み、合成、排出、酸化のアンバランスから生じる7。脂肪肝は可逆的で無症状の病変であり、長い間良性と考えられてきた。しかし、現在では、脂肪肝は脂肪肝炎の前駆症状であり、肝組織学的に、脂肪沈着、肝細胞のバルーン化、マロリー小体、浸潤マクロファージや白血球を伴う小葉の炎症が存在することで定義されることが認められている8,9。この仮説に沿い、我々はトランスクリプトーム解析を用いて、炎症過程に関与する遺伝子が淡泊な脂肪症患者で有意に発現上昇していることを証明し10、NAFLはそれほど良性ではないという主な考えを導き11、脂質そのものが炎症を誘発する可能性を示唆した。より正確には、飽和脂肪酸、リン脂質、セラミドシグナル伝達やコレステロール含量の乱れなど、いくつかの脂質種が炎症促進作用やアポトーシス促進作用を示すことが報告されている7,12,13,14。したがって、脂肪肝からNASHへの進行は、脂質組成に関係している可能性がある。ヒトを対象としたいくつかの研究では、NAFLDに関与する脂質を同定するために、包括的な肝リピドミクス解析に焦点が当てられている15,16,17。これらの研究では、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、長鎖脂肪酸（LCFA）のホメオスタシスの変化が明らかにされている。しかし、いずれの研究も、NASHに特異的な脂質の特徴やメカニズムを明らかにすることはできなかった。したがって、NASHの進行に関連する潜在的な毒性を持つ脂質を同定することは、未だ満たされていないニーズである。

本研究では、NAFLまたはNASH患者から採取したヒト肝生検の比較リピドミクス解析を行った。我々は、最近動物モデルで実施した不偏の数学的アプローチを採用した。実際、我々は、ランダムフォレストに基づく数学的アプローチにより、マウスモデルにおいてNASHに特異的な肝脂質シグネチャーを特徴付けることが可能であることを実証している18。NASH患者では、LCFAと超長鎖脂肪酸（VLCFA）の合成に関与する代謝経路の変化に関連するNASHの脂質シグネチャーの普遍的な特徴を示した。最後に、NASHにおいて選択的に蓄積される脂質は、ヒト肝細胞に対して非常に毒性の高い混合物であることを示した。

リピドミクスと機械学習による解析でNAFLDの脂質シグネチャーが明らかになった

肝臓の病態を識別する脂質を同定するために、定量的リピドミクス解析を行った。本研究は、同じ病院（Hôpital Paul Brousse, Villejuif, France）で採取された、コントロールとしての正常肝臓（n = 7）、非アルコール性脂肪肝（NAFL, n = 39）、非アルコール性脂肪肝炎（NASH, n = 15）を含む61の肝生検で実施された（表1）。脂質は肝臓組織から抽出され、さらに質量分析（GC/LC-MS）と結合した気相または液相クロマトグラフィーによって同定された。これにより、コレステロール、コレステリルエステル（CE、n = 3）、ジアシルグリセロール（DG）1種、トリグリセリド（TG、n = 5）、脂肪酸（n = 21）などの104種の脂質が同定および定量された、 セラミド（Cer、n=4）、ホスファチジルコリン（PC、n=18）、ホスファチジルエタノールアミン（PE、n=16）、ホスファチジルイノシトール（PI、n=14）、ホスファチジルセリン（PS、n=11）、スフィンゴミエリン（SM、n=11）。

まず、NAFLから採取した39の肝生検において、異なるグレードの脂肪症を区別することを試みた。そこで、不均衡に関連するバイアスを回避し、NAFLグループ間の患者の均質な再分割を保証するために、分類回帰木（CART）分析を採用した。実際、われわれは以前、この方法を用いて、トリグリセリド（TG）の総量が、通常「ゴールドスタンダード」と考えられている組織学的検査よりもはるかに良好に、脂肪症の悪性度を不偏的に識別できることを証明した19。本研究では、CARTアプローチにより、総TG量に基づいて非アルコール性脂肪肝の3つのグループ、すなわちNAFL1（41.7＜TG＜220nmol/mgタンパク質；n＝9）、NAFL2（220＜TG＜465.5nmol/mgタンパク質；n＝12）およびNAFL3（TG＞465.5nmol/mgタンパク質；n＝18）を個別化した（補足図S1参照）。各群の患者数がさらなる統計解析に適しているかどうかを確認した。多変量分散分析（MANOVA）による統計的パラメトリック検定を行ったところ、1群平均9人で、最低54人の患者数が示された。合計61人の患者を登録したわれわれの研究グループは、この分野で発表された他の研究（表1）15,21,22,23,24と比較して上限の範囲内であった。

調査はさらに、ランダムフォレストをベースとした機械学習アプローチを用いて行われた。この不偏の統計解析により、それぞれ数百の変数を示す複数のグループを比較することができ、特定の状態の予測変数を特徴付けることができる18,25。調査は、正常肝（n=7）、NAFL1（n=9）、NAFL2（n=12）、NAFL3（n=18）、および「学習データセット」（NASH_Lds、n=15）と呼ばれるNASHを含む5つのグループに分布する61の肝生検から得られた104変数に対応するデータセット全体に対して行われた。無作為に事前選択された分割変数の最適数（mtry = 28、補足図S2a参照）を計算した後、ランダムフォレスト分析により、平均精度低下（MDA）スコアと平均ギニー低下（MDG）スコアに基づく32の脂質からなるシグネチャーの特徴が明らかになった（図1a、補足図S2b参照）。このようなシグネチャーは、5つのグループを互いに識別することを可能にし（図1b）、14.75％というバッグ外（OOB）推定エラー率に関連していた（補足図S2b参照）。実際、正常肝臓は、最も高い分散に関連する最初の次元に沿って、低レベルの脂肪症NAFL1と区別された。NAFL1、NAFL2、NAFL3の3群はよく識別された（図1b）。最後に、NASH_Lds患者は、プロットの2番目の次元で、他のグループから完全に分離されたコンパクトなグループとして現れた（図1b）。

(a)データは、質量分析によって分析され、重要度スコアの変数に基づいて並べられた104の脂質（列）のマトリックスの棒グラフとして表される。x軸の閾値は、垂直の赤い点線で表される、より少ない量の脂質の絶対値として計算される。判別脂質（n = 32）は、水平の赤い点線以上の脂質である。ランダムフォレスト解析は、5つの患者グループで実行された。(b)ランダムフォレストの結果に基づいて、NASH_Lds群とコントロール群、NAFL1群、NAFL2群、NAFL3群を判別する多次元尺度プロット。(c)NASH患者（NASH_Lds）を特異的に識別する32の脂質に基づく主成分分析。線は95％信頼区間を表す平均値（色のついた四角）を中心とした楕円で、pは軸に沿った分散分析のF-検定に伴う確率。(d)NAFLD患者群（コントロール＋NAFL1＋NAFL＋NAFL3）とPaul Brousse病院のNASH群（NASH_Lds）、(e)L’ccc病院のNASH群（NASH_Vds）を比較した32脂質の組み合わせに基づくROC曲線。- コントロール n = 7; NAFL1 n = 9; NAFL2 n = 12; NAFL3 n = 18; NASH_Lds n = 15, NASH_Vds n = 7。AUC： 曲線下面積；CE：コレステリルエステル；Cer： セラミド；DG：ジアシルグリセロール；NAFL：非アルコール性脂肪肝；NASH：非アルコール性脂肪肝炎；PC：ホスファチジルコリン： ホスファチジルコリン；PE：ホスファチジルエタノールアミン；PI：ホスファチジルイノシトール PC：ホスファチジルコリン、PE：ホスファチジルエタノールアミン、PI：ホスファチジルイノシトール、PS：ホスファチジルセリン、PV：予測値、SM：スフィンゴミエリン、TG：トリグリセリド。

この研究はさらに、NASHの脂質シグネチャーの検証に焦点を当てた。検証データセット」（NASH_Vds）と呼ばれるNASH患者7人の肝生検が、別の病院（Hôpital L’Archet、フランス、ニース）から追加で入手された。研究グループの特徴を表1にまとめた。これらの生検から脂質を抽出し、定量的リピドミクス解析を行った。32種類の脂質のシグネチャーを用いて、検証群NASH_Vdsの2次元プロットへの投影をNASH_Ldsに重ねた（図1c）。さらに、受信者動作特性（ROC）曲線は、32脂質の全体的なシグネチャーが、NASH_Lds（図1d、Supplemental_Excel_File_S1参照）だけでなく、NASH_Vds（図1e、Supplemental_Excel_File_S2参照）も他の患者群から100％の感度と特異度で識別できることを示した（図1dとe）。

32種類の判別脂質のうち、9種類の脂質がNASHで有意に減少しており、その主なものはセラミドとリン脂質であった。一方、NAFLおよび/またはNASHで有意な増加を示した脂質は23種で、脂肪酸6種、コレステリルエステル2種、ジグリセリド1種、トリグリセリド5種、リン脂質9種であった（図2）。

データはボックスプロットで表した。*p＜0.05、コントロール、NAFL1、NAFL2、NAFL3群と比較。+対照群、NAFL1群、NAFL2群と比較し、p＜0.05。§p＜0.05：対照群と比較。Unpaired t-testはANOVA検定の後に行った。コントロール n = 7; NAFL1 n = 9; NAFL2 n = 12; NAFL3 n = 18; NASH_Lds n = 15; NASH_Vds n = 7 NAFL: 非アルコール性脂肪肝; NASH: 非アルコール性脂肪肝炎; NASH_Lds: 学習データセット; NASH_Vds: 検証データセット。

これらの結果を総合すると、ランダムフォレストの数学的アプローチにより、NASH患者を100％の精度で識別する脂肪肝疾患のグレードの脂質シグネチャーを特徴付けることができることが示された。

NASHの脂質シグネチャーは脂肪酸合成経路の異常と関連していた

NASHで調節される代謝経路を調べた。興味深いことに、NASHで増加する6つの脂肪酸（C14:0、C16:0、C16:1n-7、C18:1n-7、C18:1n-9、C18:2n-6）はLCFA合成経路に属する（図3）。そこで、エロンガーゼとデサチュラーゼが関与するこの代謝経路の酵素活性を調べた。各酵素の活性は、リピドーム解析に基づき、その生成物と基質26の比率を測定することで推定した。

n-3、n-6、n-7およびn-9系列の長鎖飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸は、ACCおよびFASNによって産生されるミリスチン酸（C14:0）およびパルミチン酸（C16:0）から合成することができる。n-6およびn-3系列の長鎖脂肪酸もまた、食餌性前駆体から得られた前駆体から、これらの経路に示されているように、伸長（ELOVL）および脱飽和（FADS）ステップを経て合成することができる。赤色と緑色の脂質は、それぞれ我々の分析で “上 “と “下 “に見つかったものである。酵素活性の増加は赤枠で、減少は緑枠で示した。ACC：アセチル-CoAカルボキシラーゼ、ELOVL：超長鎖脂肪酸エロンガーゼ、FASN：脂肪酸合成酵素、FADS：脂肪酸デサチュラーゼ、SCD：ステアロイル-CoAデサチュラーゼ。

まず、ELOVL（超長鎖脂肪酸の伸長）と名付けられた2つの主要な伸長酵素、ELOVL5とELOVL6に注目した。ELOVL5活性は有意に増加したが（図4a、補図S3a）、ELOVL6活性は有意に減少した（図4b）。ELOVL6はラウリン酸（C12:0）からステアリン酸（C18:0）への伸長に関与している（図3）。NASHにおけるELOVL6活性の低下は、ミリスチン酸（C14:0）の蓄積を頂点とするNASHにおけるLCFAの著しい増加と一致していた（図2）。さらに、脂肪酸デサチュラーゼ1（FADS1）、FADS2およびステロイル-CoAデサチュラーゼ1（SCD1）の活性についても調べた。FADS2とSCD1の活性は、NASHにおける一価不飽和脂肪酸（C16:1n-7とC18:1n-9）と多価不飽和脂肪酸（C18:2n-6）の増加に伴って増加した（図4cとd、補足図S3bとc）。対照的に、NASHではFADS1活性の有意な低下が観察された（図4e）。さらに、多段階の基質量と生成物量の推定から、ELOVL6とFADS1が代謝経路に沿った制限酵素であることが示唆された。実際、NASH患者では、これら2つの酵素活性の低下が、経路の全体的な活性を著しく低下させていた（補足図S3d-h）。その結果、NASH患者ではn-6/n-3比が有意に上昇し、n-3インデックスが有意に低下した（図3、補足図S3i）。

酵素活性を評価するために、各反応の生成物と前駆体の比をヒトグループ（左パネル）とモデルマウス（右パネル）で使用した。(a)C20:2n-6とC18:2n-6の比を用いたELOVL5活性、(b)C18:0とC16:0の比を用いたELOVL6活性、(c)C18:3n-3とC18:2n-6の比を用いたFADS2活性、(d)C16:1とC16:0の比を用いたSCD1活性、(e)C20:4n-6とC20:3n-6の比を用いたFADS1活性の評価。データは平均値±SEMで示した。*p<0.05は他の各群と比較したt検定。コントロールと比較した場合、+<0.05、コントロールと比較した場合、§p<0.05。NAFL1とNAFL2はANOVA解析後。コントロール患者 n = 7; NAFL1 n = 9; NAFL2 n = 12; NAFL3 n = 18; NASH_Lds n = 15; NASH_Vds n = 7。対照マウス n = 10; HFD n = 5; MCDD n = 5。

NASHにおけるFADS1デサチュラーゼ活性の低下は、上流に脂肪酸を蓄積させるボトルネックになっている可能性がある。その結果、エイコサノイド前駆体（アラキドン酸（C20:4n-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5n-3）、ドコサヘキサエン酸（C22:6n-3））のような、この酵素の下流にある脂質の合成は、コントロールに比べてNASHの肝臓で有意な減少を示した（図5a）。エイコサノイド前駆体はリン脂質の合成に関与していることに注意すべきである。したがって、多価不飽和LCFAの合成の欠乏は、NASH患者で観察されたリン脂質の全体的な減少を生じさせなければならない（図5b）。

(a)アラキドン酸(C20:4n-6)、エイコサペンタン酸(C20:5n-3)、ドコサヘキサエン酸(C22:6n-3)の肝レベル。(b) 患者の各グループにおける総リン脂質。データは平均値±SEM。*p＜0.05はコントロール群と比較し、†p＜0.05はNAFL群と比較し、ANOVA解析後、p＜0.05とした。Control n = 7; NAFL1 n = 9; NAFL2 n = 12; NAFL3 n = 18; NASH_Lds n = 15; NASH_Vds n = 7 and Control n = 10; HFD n = 5; MCDD n = 5。

デサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性の変化が、それらの発現レベルと関連しているかどうかを調べるために、正常肝臓およびNAFLにマッチしたNASH患者と比較したNASHについて、ELOVL5、ELOVL6、FADS1、FADS2およびSCD1の肝臓mRNA遺伝子発現をRT-Q-PCRで調べた。年齢、性別、BMI、脂肪症グレード（すなわち脂質含量）によるmRNA遺伝子発現レベルの変動を避けるため、NAFL2グループの患者をNASH患者とマッチさせた（図2および補足図S4参照）。まず、これらの患者サブグループの脂質シグネチャーが患者グループ全体と同一であることを確認した（それぞれ図2および補足図S4）。ELOVL5 mRNAの発現は、NAFL2グループと比較して、NASHでわずかに、しかし有意に増加した（補足図S5a）。一方、ELOVL6 mRNA肝発現は、NASH患者で有意に減少し（補足図S5b）、NASHで観察される酵素活性の低さと一致した。FADS2とSCD1の遺伝子発現は、観察された酵素活性に従って、NASH患者で有意に増加した（補足図S5cとd）。FADS1に関しては、肝mRNA遺伝子発現レベルはコントロール群と比較してNASHで同程度であり、NAFL2群と比較してNASHではわずかな減少しか観察されなかった（補足図S5e）。さらに、ステロール調節エレメント結合タンパク質1c（SREBP1c）、脂肪酸合成酵素（FASN）、アセチル-CoAカルボキシラーゼ1（ACC1）など、de novo脂肪酸合成に関連する遺伝子に焦点を当てて研究を行った（図3）。ヒトの肝臓で以前に報告されたように27,28,29,30,31,32,33、SREBP1cの発現は、NAFL患者ではコントロールと比較して有意に減少していたのに対し、NASH患者ではNAFL2と比較して増加していた（補足図S5f）。興味深いことに、FASNとACC1遺伝子の発現レベルはNAFL群で有意に減少していたが、NASHでは有意に増加しており、デノボ脂肪酸合成がNASHにおけるLCFA蓄積に寄与している可能性が示唆された（補足図S5gとh）。

これらの結果を総合すると、NASHにおける脂肪酸合成経路の主要な調節異常が浮き彫りになった。NASHにおける脂質組成の変化は、ELOVL6およびFADS1活性の低下に関連した、de novo短鎖脂肪酸合成の増加、FADS2およびSCD1活性の増加という付加的な影響から生じた。これらの結果はまた、FADS1が上流ではLCFAの蓄積につながり、下流ではVLCFAの欠乏、ひいてはリン脂質合成の欠乏につながるボトルネックであると位置づけた。

脂肪酸合成経路に沿った調節異常が動物モデルで確認された

ヒトで観察される代謝の特徴は、動物モデルを用いて調査された。NAFLとNASHは、それぞれ特定の高脂肪食（HFD）とメチオニン-コリン欠乏食（MCDD）を用いることでマウスに誘導することができる14,34,35,36,37,38。我々は、患者において観察されたデータを確認するために、最近発表したこれらのマウスモデルのリピドミクス解析を利用した18。興味深いことに、MCDDマウスではElovl5、Fads2、Scd1活性も上昇していた（それぞれ図4a、c、d）。対照的に、Elovl6とFads1活性は低下していた（それぞれ図4bとe）。アラキドン酸（C20:4n-6）、エイコサペンタエン酸（C20:5n-3）、ドコサヘキサエン酸（C22:6n-3）といったFads1の下流で合成される脂質の量は、MCDDを与えたマウスの肝臓で劇的に減少した（図5a）。

これらの観察結果は、ヒト患者と動物モデルの両方において、脂肪酸合成経路に沿った共通の代謝異常がNASHの発症につながっていることを示している。

NASHに蓄積した脂質の特定の混合物は、肝細胞に高い毒性を示した。

れた平均濃度に基づいて構成した（表2）。HepG2細胞とHPHを、50μMから1000μMまで同じ最終濃度で、このようなミックスとインキュベートした。興味深いことに、NASHミックスは両肝細胞に対して有意に高い毒性を示した。さらに、NASHミックスの脂質毒性は低濃度でも観察された（図6dとe）。これらの結果は、NASHに蓄積された特定の混合脂質の強力な毒性を示している。